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一、基本原理 1971年Engvall和Perlmann發(fā)表了酶聯(lián)免疫吸附劑測定(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)用于IgG定量測定的文章,使得1966年開始用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的測定方法。 這一方法的基本原理是:①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體,這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性,又保留酶的活性。在測定時(shí),把受檢標(biāo)本(測定其中的抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗
內(nèi)參抗體可用于評價(jià)蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)的效率,比較凝膠中每孔的蛋白上樣量。此類對照可幫助確定樣品間表達(dá)水平的差異,以判斷是由細(xì)胞裂解物的實(shí)際蛋白水平導(dǎo)致,還是由上樣量的差異導(dǎo)致。 內(nèi)參抗體主要功能 (1)檢測整個(gè)WB流程是否正常 (2)檢測基因表達(dá)產(chǎn)物是否正確 (3)比較產(chǎn)物微量的相對變化 (4)評價(jià)各個(gè)上樣孔內(nèi)蛋白的總量是否基本一致 圖一示例 內(nèi)參抗體在目標(biāo)蛋白的免疫熒光研究中,也可以作為共染的陽性對照。內(nèi)參抗體分為未標(biāo)記型和標(biāo)記型,標(biāo)記物包括生物素、HRP、FITC、PE、Cy染料和Alexa Fluor染料。
樣品收集注意事項(xiàng) 1. ? 樣品收集后若在1周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃,若不能及時(shí)檢測,請按一次使用量分裝 (ELK Biotechnology單指標(biāo)夾心法試劑盒,單孔標(biāo)準(zhǔn)上樣量為100μl?),凍存于-20℃(1個(gè)月內(nèi)檢測),或-80℃(3個(gè)月內(nèi)檢測),避免反復(fù)凍融。融化樣本在試驗(yàn)前請?jiān)俅坞x心以去除凍融后可能出現(xiàn)的沉淀物。 2. ? 試劑盒檢測范圍不等同于樣本的濃度范圍,如果您的樣品中檢測物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值,請根據(jù)實(shí)際情況,做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建議查閱文獻(xiàn)后先做預(yù)實(shí)驗(yàn),以確定稀釋倍數(shù))。 3. ? 若所檢樣本不在說明書所列樣本之中,建議做預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其檢測有效性。
方法一:使用Curve Expert1.4軟件(點(diǎn)擊下載Curve Expert1.4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 可以采用各種繪圖軟件來繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,下面以“Curve Expert1.4”軟件為例,繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法如下; 1.啟動“Curve Expert” 2.X軸輸入標(biāo)準(zhǔn)品的OD值(雙抗夾心輸入OD-空白值),Y軸輸入所對應(yīng)的濃度值,如圖: 3.單擊[運(yùn)行] 按鈕,出現(xiàn)如下對話框 4.單擊[ok
貼壁細(xì)胞總蛋白提?。? 用TBS緩沖液潤洗貼壁細(xì)胞2-3次,最后一次盡量吸干殘留液。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑(使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入蛋白酶抑制劑)于培養(yǎng)板/瓶內(nèi)裂解3-5min。期間反復(fù)晃動培養(yǎng)板/瓶,使試劑與細(xì)胞充分接觸。用細(xì)胞刮刀將細(xì)胞及試劑刮下,收集到1.5mL離心管中。冰浴30min,期間用移液器反復(fù)吹打,確保細(xì)胞完全裂解。4℃13000g離心5min,收集上清,即為總蛋白溶液。 懸浮細(xì)胞總蛋白提?。? 低速離心收集細(xì)胞,加入適當(dāng)體積的冷卻的PBS緩沖液重懸,2000rpm離心10min,吸除上清。重復(fù)以上操作兩次,收集細(xì)胞沉淀。加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑(使用
(1)引物干粉開蓋前13000rpm,室溫離心1min。 (2)加入管壁上10倍nmole數(shù)值的水(μL)的DEPC水,渦旋混勻,瞬時(shí)離心。此為引物儲備液(100μM),用后于-20℃保存。 *引物管上一般是3.0~6.0nmole,加入十倍這個(gè)數(shù)值微升的水(30~60μL)。 (3)取一新1.5mL EP管,加入380μLDEPC水,上下游引物儲備液各吸取10μL于新EP管中,渦旋混勻,瞬時(shí)離心。此為引物工作液(2.5μM),可直接用于實(shí)驗(yàn),用后于4℃保存。
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